ลักษณะโครงสร้างของยีนและยีโนม
ยีโนม (Genome) คือสารพันธุกรรมทั้งหมดของสิ่งมีชีวิตซึ่งบรรจุอยู่ในเซลล์ โดยมีอยู่ในนิวเคลียสและในไมโตรคอนเดรีย โดยร้อยละ 99.99 ของยีโนมอยู้ในนิวเคลียส ยีโนมที่พบภายในนิวเคลียส (nucleus DNA) มีแหล่งกำเนิดมาจาก 2 แหล่งคือ ดีเอ็นเอที่ได้จากไข่ (แม่) และดีเอ็นเอที่ได้จากน้ำเชื้อ (พ่อ) ดังนั้นดีเอ็นเอในนิวเคลียสจึงเป็นตัวกำหนดลักษณะเฉพาะของบุคคลหรือสัตว์แต่ละตัวและถูกนำมาใช้ในการศึกษาลักษณะการถ่ายทอดทางพันธุกรรมเช่น โรคทางพันธุกรรม การวิเคราะห์การกลายพันธุ์ รวมถึงการพิสูจน์ความสัมพันธ์ทางสายเลือด เป็นต้น
ยีโนมจะอยู่ในรูปของกรดนิวคลีอิกชนิดดีเอ็นเอที่ต่อกันเป็นสายพันขดกันอยู่ในแท่งโครโมโซมดีเอ็ฯเอสายสาวเหล่านี้จะพันอยู่รอบโปรตันฮีสโตน (Histone) โดยโครโมโซมทั้งหมดของโคมี 60 เส้นหรือ 30 คู่ แบ่งออกเป็น
- โครโมโซมร่างกาย (autosomal chromosome) มี 29 คู่ ทั้งในเพศผู้และเพศเมีย
- โครโมโซม เพศ (sex chromosome) มี 1 คู่ โดยที่ในเพศผ้จะมีโครโมโซม X และโครโมโซม Y อย่างละ 1 โครโมโซมีสัญลักษณ์เป็น XY ส่วนเพศเมียจะมีโครโมโซม X สองตัวมีสัญลักษณ์เป็น XX
หน้าที่ของโครโมโซม คือ การถ่ายทอดสารพันธุกรรมจากชั่วอายุหนึ่งไปยังชั่วอายุหนึ่ง โดยข้อมูลทางพันธุกรรมหรือหน่วยพันธุกรรมจะถูกบันทึกในรุปของยีน ยีนหมายถึงส่วนของดีเอ็นเอที่มีขนาดและลำดับเบสต่าง ๆ ที่เฉพาะเจาะจง เพื่อกำหนดและควบคุมปรากฎการณ์ต่าง ๆ ที่เกิดขึ้นภายในเซลล์ เป้นรหัสสำหรับสังเคราะห์ โปรตีนและลักษณะการแสดงออกของโปรตีนต่าง ๆ รวมทั้งการแสดงออกทางเพศ เช่น บนโครโมโซมเพศจะมีส่วนของดีเอ็นเอหรือยีน ที่ใช้ในการกำหนดลักษณะการแสดงออกของเพศ ซึ่งสามารถแยกความแตกต่างระหว่างเพศผู้และเพศเมียได้จากยีนที่อยู่บนโครโมโซม Y (Y-specific gene) เป็นต้น การกำหนดเพศโดยใช้โครโมโซม Y กำหนดเพศผู้กล่าวคือ เพศผู้มีโครโมโซมเป็น XY สร้างเซลล์สืบพันธุ์ 2 ชนิด คือ เซลล์สืบพันธุ์ที่มีโครโมโซมเพศเป็น X หรือ Y เพศเมียมีโครโมโซมเป็น XX สร้างเซลล์สืบพันธุ์ได้ชนิดเดียว คือเซลล์สืบพันธุ์ที่มีโครโมโซมเพศเป็น X
วิธีการตรวจยืนยันเพศ (Gender Verification)
การตรวจยืนยันเพศอาศัยเทคนิคทางห้องปฏิบัติการด้านเซลล์พันธุศาสตร์ และอณูพันธุศาสตร์ดังนี้
1. การทำคารีโอไทป์ (Karyotyping)
2. การทำ Fluorescence in situ hybridization (FISH)
3. การทำ Polymerase chain reaction (PCR)
1. การทำคารีโอไทป์ (Karyotyping)
การทำคารีโอไทป์เป็นวิธีหนึ่งในเซลล์พันธุศาสตร์ ที่ใช้ศึกษาโครโมโซมที่สนใจทั้งจากคน พืชและสัตว์ โดยการเรียงโครโมโซมอย่างเป็นระบบให้อยู่เป็นกลุ่มต่าง ๆ ตามขนาด รูปร่างและตำแหน่งของเซนโทรเมียร์ สามารถใช้ตรวจสอบความผิกปกติของจำนวนและรูปร่างลักษณะของโครโมโซม และใช้ในการตรวจยืนยันเพศ
ขั้นตอนการทำคารีโอไทป์
1. เก็บตัวอย่างเลือดนำมาเพาะเลี้ยงเซลล์เม็ดเลือดขาวโดยเก็บในตู้บ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 72 ชั่วโมง
2. ใส่สาร colcemid เพื่อให้โครโมโซมหยุดการแบ่งเซลล์ที่ระยะเมทาเฟส (metaphase)
3. นำเซลล์มาหยดบนสไลด์ (fix cell) แล้วย้อมด้วยสีจิมซา
วิเคราะห์ผลโดยส่องดูโครโมโซมด้วยกล้องจุลทรรน์ (microscopy) ซึ่งอาจใช้โปรแกรมคอมพิวเตอร์ช่วยจัดเรียงโครโมโซมให้อยู่เป็นคู่ ๆ
การแปรผล
- เพศผู้จะพบโครโมโซมเพศเป็น XY
- เพศเมียจะพบโครโมโซมเพศเป็น XX
ข้อดี
1. เป็นวิธีที่ได้รับการพัฒนามานานและมีความถูกต้องแม่นยำ
2. มีโปรแกรมวิเคราะห์ทางคอมพิวเตอร์ทำให้มีความน่าเชื่อถือ สามารถใช้เป็นการตรวจแบบมาตรฐานทางห้องปฏิบัติการ
ข้อจำกัด
1. ต้องอาศัยผู้อ่านที่มีประสบการณ์และใช้ระยะเวลานานในการฝึกฝน
2. ต้องใช้แรงงานคนในหลายขั้นตอน ไม่สามารถทำเป็นวิธีอัตโนมัติทุกขั้นตอน
3. ต้องใช้เวลามากในการอ่านคารีโอไทป์
4. ไม่สามารถตรวจความผิดปกติที่มีขนาดเล็กบนโครโมโซมได้
2. การทำ Fluorescence in situ hybridization (FISH)
เป็นวิธีการตรวจความผิดปกติ หรือตำแหน่งของยีนแลโครโมโซม ที่ไดรับการพัฒนามาจากการตรวจทั้งระดับอณูพันธุศาสตร์ และเซลล์พันธุศาสร์ เพื่อแก้ไขข้อจำกัดของการตรวจทั้ง 2 วิธีโดยการนำฟลูออเรสเซนซ์อินซิตูไฮบริไดเซชั่น หรือ Fluorescence in situ hybridization (FISH) โดยอาศัยความรู้จากอณูพันธุศาสตร์ออกแบบ Probe เพื่อใช้เป็น DNA ตรวจสอบ โดยมีการติดฉลากด้วยสารเรืองแสงเพื่อให้เห็นเป็นสัญญาณสี เมื่อดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ฟลูออเรสเซนซ์ โดยดูสัญญาณสีที่ปรากฎขึ้นหรือหายไปของ Probe
หลักการของ FISH
ส่วนของ DNA หรือ RNA สายเดี่ยวที่ติดฉลากที่เรียกว่า "Labeled Probe" เช่น BtY2 sequences ติดฉลากสีด้วย biotin-16-dUTP (Bty2-L1 Probe) เป็นต้น จะมีการเรียงตัวของ นิวคลีโอไทด์ที่เป็นคู่สมกับ DNA หรือ RNA เป้าหมายสามารถจับ DNA หรือ RNA เป้าหมายนั้นเกิดเป็น Hybrid ภายใต้ภาวะที่เหมาะสม
1. Direct Method วิธีนี้สารเรืองแสงจะจับหรือติดอยู่กับ Labeled Probe โดยตรงทำให้ตรวจหาสัญญาณได้ทันทีหลังจากเกิด Hybridization
2. Indirect Method วิธีนี้ Probe จะติดฉลากด้วยสาร Haptens (Haptens Modified Probe) เช่น Biotin, Digoxigenin, Photobiotin, Bromodeoxy-uridine เป็นต้น แล้วจึงตรวจหาสัญญาณด้วยสารเรืองแสงอีกชิ้นหนึ่ง โดยติกดสารเรืองแสงไว้กับ Specific Antibodies ต่อ Haptens นั้นหรือสารที่มีคุณสมบัติพิเศษเช่น Streptavidin เป็นต้น
ขั้นตอนการทำ FISH
1. เก็บตัวอย่างเลือด นำมาเพาะเลี้ยงเซลล์เม็ดเลือดขาว โดยเก็บในตู้บ่มเพาะเชื้อที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส นาน 72 ชั่วโมง
2. ใส่สาร Colcemid เพื่อให้โครโมโซมหยุดการแบ่งตัวที่ระยะเมตาเฟส แล้วทำการเก็บเซล์
3. หยดเวลล์ลงบนสไลด์ทำให้ DNA ที่จำเพาะกับโครโมโซมแยกออกเป็นสายเดี่ยว (Denaturation)
4. ใช้ Probe ไปจับกับสาย DNA ที่จำเพาะกับโครโมโซม X และ Y (Hybridization)
5. ส่องดูโครโมโซม ด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์ โครโมโซม ที่ Probe เข้าไปจับได้จะเรืองแสงฟลูออเรสเซนซ์เห็นเป็นสัญญาณสี
ข้อดี
1. อ่านคารีโอไทป์ได้ง่ายขึ้นและชัดเจน เพีงดูสัญญาณสีที่ปรากฎขึ้น
2. สามารถตรวจโรคที่มีความผิดปกติเยงหนึ่งอัลลีลได้ และถ้ามีการพัฒนา Probe ไห้มีสัญญาณสีที่แตกต่างกันในแต่ละยีนหรือโครโมโซม ก็จะสามารถตรวจยีนที่มีความผิดปกติ ได้หลายตำแหน่ง
ข้อจำกัด
1. ตรวจความผิดปกติได้เฉพาะยีน หรือโครโมโซมที่ Probe เข้าไปจับได้เท่านั้น
2. ต้องใช้กล้องจุลทรรศน์ ฟลูออเรสเซนซ์ ในการตรวจสอบสัญญาณสีจาก Probe
3. การทำ Polymerase chain reaction (PCR)
PCR เป็นการตรวจทางด้านอณูพันธุศาสตร์ เป็นวิธีสังเคาะห์ดีเอ็นเอสายค่ในหลอดทดลองอย่างต่อเนื่อง โดยอาศัยการเร่งปฏิกิริยาของเอ็นไซม์ DNA polymerase ที่ทนความร้อนในหลอดทดลอง ที่มี deoxy nucleotide triphosphate (dNTP) ในส่วนประกอบของสารละลายที่เหมาะสม โดยแต่ละลำดับของปฏิกิริยา PCR จะถูกควบคุมโดยเครื่อง Thermal cycle ปฏิกิริยา PCR จะทำการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ บริเวณระหว่าง Oligonucleotide primer 2 สาย ซึ่งเรียกว่า forward primer และ reverse primer
องค์ประกอบในการทำ PCR
1. ดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) ที่ประกอบด้วยส่วนของยีนหรือ ดีเอ็นเอที่เราต้องการสังเคราะห์
2. Oligonucleotide primer เป็น nucleotide สายสั้น ๆ ซึ่งเริ่มต้นจับกับยีนหรือดีเอ็นเอต้นแบบสายตรงข้ามซึ่งเป็นคู่สมกัน
3. deoxy nucleotide triphosphate (dNTP) คือเบส ที่จะถูกนำเข้าไปต่อจากสาย primer ทำให้ได้ดีเอ็นเอสายใหม่
4. เอนไซม์ DNA polymerase เป็นเอนไซม์ที่ทนความร้อนทำให้สามารถใช้ในปฏิกิริยา PCR ได้หลาย ๆ รอบ ทำหน้าที่สังเคราะห์สาย DNA อจาก primer โดยการนำนิวคลีโอไทด์ (dNTP) ทีเหมาะสมเข้าไปต่อทีละตัว
5. Buffer เป็นสารละลายที่ทำให้ปฏิกิริยา PCR เป็นไปได้อย่างเหมาะสมซึ่งประกอบด้วย Tris HCI, KCI และ MgCI2 โดยที่ความเข้มข้นของ Mg2+ จะมีผลต่อปฏิกิริยาอย่างมาก
วงรอบปฏิกิริยา (PCR cycle)
ในแต่ละรอบของปฏิกิริยา PCR ประกอบด้วย 3 ขั้นตอนดังนี้
1. Heat denaturatin step เป็นขั้นตอนการแยกดีเอ็นเอต้นแบบซึ่งเป็นสายคู่ให้เอ็นดีเอ็นเอสายเดี่ยวโดยใช้ความร้อนที่อุณหภูมิประมาณ 90-95 องศาเซลเซียส เพื่อละลายพันธะไฮโดรเจน ระหว่างสายของดีเอ็นเอทำให้ได้ดีเอ็นเอสายเดี่ยว 2 สาย
2. Primer annealing step เป็นขั้นตอนที่ทำให้ primer ทั้ง 2 เส้น ไปเข้าคู่กับดีเอ็นเอเป้าหมายที่เป็นคู่สมกัน โดยลดอุณหภูมิลงมา อุณหภูมิที่เหมาะสมอยู่ในช่วง 40-60 องศาเซลเซียส
3. Extension step เป็นขั้นตอนที่เอนไซม์ DNA polymerase สังเคราะห์สายดีเอ็นเอต่อจาก Primer โดยการนำนิวคลีโอไทด์ (dNTP) ที่เหมาะสมเข้าไปต่อทีละตัว ที่อุณหภูมิประมาณ 70-75 องศาเซลเซียส
ในแต่ละรอบของการสังเคราะห์ดีเอ็นเอจะได้จำนวนของดีเอ็นเอเพิ่มขึ้นแบบทวีคูณ ปริมาณของดีเอ็นเอที่ได้เมื่อสิ้นสุดรอบสุดท้ายของปฏิกิริยาสามารถคำนวณได้จากสูตร 2n เมื่อ n คือจำนวนรอบของปฏิกิริยา
การตรวจวิเคราะห์ผล
เมื่อปฏิกิริยา PCR เสร็จสิ้นลงขั้นตอนต่อไปคือ การตรวจวิเคราะห์ผลผลิตของ PCR (PCR Product) โดยวิธีที่สะดวกและเป็นนิยมคือ การใช้ agarose gel electrophoresis และย้อมด้วยสารเรืองแสง ethidium bromide และนำไปส่องด้วยเครื่อง ultraviolet transilluminator จะทำให้สามารถมองเป็นแถบดีเอ็นเอใน gel ได้
ข้อดี
1. PCR เป็นวิธีที่มีความจำเพาะ และความไวสูง ไม่จำเป็นต้องมี ดีเอ็นเอ ต้นแบบในปริมาณมาก
2. มีความรวดเร็วในการสังเคราะห์สายดีเอ็นเอให้ได้ในปริมาณมากโดยใช้เวลาเพียง 1-3 ชั่วโมง
3. มีความถูกต้อง แม่นยำสูงในการตรวจวิเคราะห์ เช่นการตรวจโรค หรือความผิดปกติของยีน เป็นต้น
ข้อจำกัด
1. ต้องทราบลำดับเบส ของดีเอ็นเอส่วนปลายหัวท้ายของชิ้นดีเอ็นเอที่ต้องการเพิ่มจำนวน เพื่อนำมาออกแบบ primer
2. ต้องสังเคราะห์ primer ให้เหมาะสมกับวัตถุประสงค์ในการศึกษา
3. ต้องทำในสภาวะที่เหมาะสมกับ primer แต่ละชนิด
4. เกิดผลบวกปลอมหรือผลลบปลอมได้ง่ายหากมีการปนเปื้อน
|
