การผลิตเอ็มบริโอโคในร่างกายด้วยการเร่งการตกไข่

              ในช่วง 30 ปีที่ผ่านมา มีการเปลี่ยนแปลงน้อยมาก ยังคงเร่งการตกไข่โดยใช้ฟอลลิเคิลสติมูเลติงฮอร์โมน (FSH) ในรูปแบบเดิมคือ ฉีด 4 วัน ๆ ละ 2 ครั้ง ห่างกัน 12 ช.ม. และค่าเฉลี่ยของเอ็มบริโอ ที่ได้คือ 5.5 เอ็มบริโอต่อครั้ง ตั้งแต่ปี 1999 เริ่มมีการใช้แท่งโปรเจสเตอโรนฝังหู เพื่อควบคุมวงรอบการเป็นสัดของโคตัวให้และบางครั้ง ก็มีการกำจัดฟอลลิเคิลนำบนรังไข่ ก่อนเริ่มโปรแกรมเร่งการตกไข่ แต่ผลที่ได้ก็ไม่ดีขึ้นกว่าเดิม อย่างไรก็ตามการจัดการเร่งการตกไข่ได้มีการพัฒนาให้สามารถเพิ่มการผลิตเอ็มบริโอในต่อระยะเวลาได้มากขึ้น คือสามารถเร่งการตกไข่ได้มากครั้งขึ้นในรอบเวลาเท่าเดิม ตามปกติตัวให้สามารถทำการเร่งการตกไข่ซ้ำได้หลังจากมีรอบการเป็นสัด 2 รอบ จะ ใช้เวลาประมาณ 65-70 วัน จึงจะเร่งการตกไข่ซ้ำได้ แต่โปรแกรมเร่งการตกไข่ใหม่ที่เรียกว่า DQTA-Donor Quick Turn Around สามารถช่วยร่นระยะเวลาเร่งการตกไข่ ได้ทุก ๆ 40 วัน โดยการฉีด โพรสตาแกลนดิน (PGF2a) และสอดโปรเจสเตอโรน ทันทีหลังจากซะล้างเอ็มบริโอเสร็จ อีก 10 วันต่อมา ถอนโปรเจสเตอโรนออก และทำการเร่งการตกไข่อีกตรั้ง ในวงรอบการเป็นสัดต่อมา และถ้าโคไม่เป็นสัดภ่ายใน 3 วัน หลังจากถอนโปรเจสเตอโรนออก จะทำการสอดโปรเจสเตอโรนใหม่ และเริ่มโปรแกรมเร่งการตกไข่อีก 5 วันต่อมาจากการใช้โปรแกรม DQTA ในโคแองกัส พบว่า ในรอบ 18 เดือน สามารถเร่งการตกไข่ได้เฉลี่ย 13.8 ครั้ง (11-16ครั้ง) ได้เอ็มบริโอเฉลี่ย 5.5 เอ็มบริโอ

การทำแฝดเหมือนด้วยการผ่าแบ่ง

              เทคนิคการผ่าแบ่งเอ็มบริโอตั้งแต่ระยะมอรูลาขึ้นไป เพื่อผลิตแฝดเหมือนได้พัฒนาไปอย่างรวดเร็วมาก และได้ประยุกต์ ใช้ในอุตสาหกรรมการย้ายฝากเอ็มบริโอในโค (Baker และ Shea, 1985) ซึ่งการทำแฝดเหมือนจากเอ็มบริโอ ที่มาจากโคพันธุ์ดี ทำให้เพิ่มจำนวนของสัตว์พันธุ์ดีได้รวดเร็วขึ้นด้วย อัตราการตั้งท้องด้วยการย้ายฝากแบบไม่ผ่าตัดของครึ่งเอ็มบริโอมีอัตราเท่ากับย้ายฝากเอ็มบริโอเต็มใบ ซึ่งเทคนิคนี้ได้รับการพัฒนาให้ง่ายขึ้นด้วย การใช้ชิ้นส่วนเล็ก ๆ ของใบมีการโกนหนวดหรือเข็มแก้วเล็ก ๆ สำหรับการผ่าแบ่งครึ่ง (Willadsen และคณะ 1981; Seidel, 1982; William และคณะ 1984) ซึ่งหลังจากการผ่าแบ่งแล้วเซลล์ของเอ็มบริโอครึ่งใบก็จะรัดตัวแน่นเข้าและสร้างโพรงภายใน ซึ่งสามารถใช้ย้ายฝากได้โดยตรงเลย ซึ่งจากเทคนิคนี้สามารถจะผลิตแฝดเหมือนได้สูงถึง 50% และสามารถผลิตลูกสัตว์ได้มากกว่าจขำนวนเอ็มบริโอ เมื่อเริ่มต้นการผ่าแบ่ง ดังนั้นเทคนิคนี้จึงช่วยเพิ่มอัตราการตั้งท้องของการย้ายฝากเอ็มบริโอให้ได้ผลมายิ่งขึ้นแต่เทคนิคนี้จำเป็นต้องได้รับการฝึกฝนให้มีความชำนาญมากเป็นพิเศษ เพื่อให้ประสบผลสำเร็จที่ดีในการผ่าแบ่ง และเป็นเทคนิคที่ใช้ควบคู่ไปกับการย้ายฝากเอ็มบริโอ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของการย้ายฝากเอ็มบริโอให้สูงขึ้น

การผลิตเอ็มบริโอนอกร่างกาย (IVP-in vitro production)

              มีขั้นตอนเรียงลำดับดังนี้ คือการเลี้ยงโอโอไซต์ให้สุก (IVM-in vitro maturation) แล้วนำไปปฏิสนธินอกร่างกาย (IVF-in vitro fertilization)กับอสุจิ ก่อนจะนำไปเลี้ยงต่อในตู้อบ (IVC-in vitro cuture) จนพัฒนาเป็นเอ็มบริโอ เรื่อยมาซึ่งสามารถเลี้ยงได้จนเอ็มบริโอหลุดออกจาก โซนาเพลูซิดา มาเกาะกับพื้นจานเลี้ยง การผลิตเอ็มบริโอโดยผ่าน IVF นี้สามารถผลิตเป็นปริมาณมากได้ ด้วยการใช้รังไข่จากโรงฆ่าสัตว์ โดยในปี 1992 มีรายการโดย Lu และ Polge ว่าได้มีการผลิตเอ็มบริโอโดย IVF จนถึงระยะบลาสโตซีส กว่า 200,000 เอ็มบริโอ จากโอโอไซต์ ประมาณ 700,000 โอโอไซต์ แต่โครงการนี้ดำเนินงานอยู่ได้ไม่นาน ในปัจจุบัน การผลิตเอ็มบริโอโดย IVF ก็ยังมีการดำเนินการอยู่ ในบางประเทศที่ลูกโคที่ได้ระบบการผลิตนี้มีมูลค่า หรือคุณค่าสูง คุ้มค่ากับการลงทุน แต่เอ็มบริโอที่ได้จาก IVF จะมีความแตกต่างจากเอ็มบริโอ ที่ผลิตในร่างกายโค คือ เซลล์ในระยะมอรูลา จะเกาะกันไม่แน่น ช่องว่างระหว่างโซนาเพลูซินาแคบกว่า เอ็มบริโอไปย้ายฝากจะตั้งท้องในอัตราที่ต่ำกว่าเอ็มบริโอที่ผลิตในร่างกายและปรากฎความผิดปกติในการตั้งท้องและลูกที่เกิดมา ดังนี้ ระยะการตั้งท้องยาว ลูกขนาดใหญ่ การแสดงอาการคลอดน้อยลง มีการแท้งมากขึ้น อวัยวะไม่ครบ มีการตายระหว่างคลอดมากขึ้น มีน้ำในรกมากขึ้น

การโคลนนิง

              เป็นการผลิตเอ็มบริโอนอกร่างกายอีกวิธีหนึ่ง แตกต่างจาก IVF ตรงที่ไม่มีการปฏิสนธิกับอสุจิ แต่ หลังจากได้โอโอไซต์ สุกจาก IVM แล้ว จะทำการดูดเอานิวเคลียสของโอโอไซต์ออกซึ่งจะมีอยู่ 2 ส่วน ส่วนหนึ่งอยู่ในโพลาบอดี อีกส่วนหนึ่งจะอยู่ใน ไซโตพลาสม (cytoplasm) โดยจะอยู่บริเวณใกล้ ๆ กับโพลาบอดี โดยใช้เข็มแก้วขนาดเล็กมาก ที่ควบคุมด้วยแขนกล (micro manipulator) ทำภายใต้กล้องจุลทรรศน์ชนิดหัวกลับ (inverted microscope) โอโอไซต์สุกที่ดูดเอานิวเคลียสออกแล้ว นำมาฉีดเซลล์ต้นแบบ 1 เซลล์ เข้าไปให้แนบกับไซโตพลาสมแล้วกระตุ้นด้วยกระแสไฟฟ้าแรงดันต่ำ ๆ ในระยะเวลาสั้นมาก ๆ เพื่อให้เซลล์ต้นแบบเชื่อมและหลอมรวมกับตัวไข่ตัวรับเซลล์ แล้วจึงนำไป IVC ต่อไป
การใช้เซลล์ร่างกายเพื่อผลิตเอ็มบริโอโคลนนิง เป็นการเปิดโอกาสให้สามารถทำให้เกิดการดัดแปลงพันธุกรรมได้ด้วยขบวนการที่เรียกว่า gene transfection ซึ่งเข้ามาแทนที่เทคนิคการถ่ายฝากยีนส์แบบ pronuclear injection ถึงแม้ว่าในการผลิตเอ็มบริโอโคลนนิงเราจะใช้เซลล์ร่างกายได้จากหลากหลายส่วนของร่างกาย แต่ก็มีเซลล์ร่างกายจากบางส่วนเท่านั้นที่ใช้ในการทำ gene transfection ได้และยีนส์ที่จะทำการถ่ายฝากด้วยวิธีนี้จะต้องเป็นยีนส์ที่มี DNA ที่เรียงลำดับกันไม่ยาว (5-30 kb) จึงจะประสบผลสำเร็จในการฝากถ่ายยีนส์ ได้รวดเร็วโดยการใช้ เทคนิค DNA microarrays ในปี 2003 Robl และคณะ รายงานว่าได้ผลิตลูกโคจากเอ็มบริโอถ่ายฝากยีนส์ ที่มีโครโมโซมเทียมของมนุษย์ ได้ 21 ตัว ซึ่งมีบางตัวสามารถผลิต polyclonal antibodies ของมนุษย์ได้เทคโนโลยีการถ่ายฝากยีนส์นี้ ส่วนใหญ่จะทำเพื่อผลิตเอ็มบริโอ โคลนนิงที่ต่อเนื่องจากเอ็มบริโอโคลนนิง ที่ผ่านการถ่ายยีนส์มาแล้ว เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการผลิตเนื้อ นม ดัดแปลง องค์ประกอบของน้ำนม หรือ ปรับปรุงการต้านทานโรค ดังนั้นการใช้ประโยชน์ของเอ็มบริโอที่ดัดแปลง พันธุกรรมแล้ว คงจะเกิดขึ้นในอุตสาหกรรมการผลิตยาก่อน จึงจะมีการนำมาใช้ในอุตสาหกรรมการผลิตโค ซึ่งคงจะใช้เวลาอีกหลายสิบปี

              สรุปขั้นตอนการโคลนนิง ในโคเนื้อ  

              1. เตรียมเซลล์ต้นแบบโดยใช้ เซลล์เนื้อเยื่อผิวหนัง จากโคต้นแบบที่ต้องการขยายพันธุ์

              2. ผลิตเอ็มบริโอจากเซลล์ต้นแบบภายนอกร่างกาย โดยมีขั้นตอนดังนี้

                     2.1 เลี้ยงโอโอไซต์ (จากรังไข่ที่ได้จากฅโรงฆ่าสัตว์หรือเจาะเอารังไข่สัตว์เป็น) ให้สุก

                     2.2 เอานิวเคลียสของโอโอไซต์สุก ออก

                     2.3 ฉีกเซลล์ต้นแบบเข้าไป แทนที่นิวเคลียสที่เอาออกไป แล้วทำให้รวมกับโอโอไซต์ ด้วยไฟฟ้า

                     2.4 เลี้ยงโอโอไซต์ ที่มีนิวเคลียส ใหม่ให้เจริญเป็นเอ็มบริโอภายนอกร่างกาย

              3. เลือกเอาเอ็มบริโอระยะบลาสโตซิสย้ายฝากให้โคตัวรับ เพื่ออุ้มท้องและคลอดลูกโคที่มีพันธุกรรมเดียวกันกับโคเจ้าของเซลล์ต้นแบบ

การเจาะเก็บโอโอไซต์จากสัตว์มีชีวิต (OPU-ovum pick up)

              เป็นอีกทคนิคหนึ่งที่นำเข้ามาช่วย ในการให้ได้มาซึ่งโอโอไซต์ สำหรับการทำ IVP ด้วยการใช้เครื่องอุลตร้าซาวด์ช่วย โดยสามารถเจาะเก็บได้สัปดาห์ละ 2 ครั้ง การกระตุ้นโคตัวให้ด้วย FSH ก่อนการเจาะเก็บ ทำให้สามารถเจาะเก็บโอโอไซต์ในแต่ละครั้งได้มากขึ้นแต่ะทำ 2 ครั้งต่อสัปดาห์ ไม่ได้ทำการ OPU นี้สามารถที่จะสนับสนุนให้มีการผลิตเอ็มบริโอในปริมาณมากจกาโคตัวให้ที่เราคัดเลือกได้ ในระยะเวลำไม่นานนัก

การแยกเพศของเอ็มบริโอ (Embryo sexing)

             ในกิจการปศุสัตว์บางอย่างเช่นโคเนือ้และโคนมเพศของลูกที่เกิดจากการย้ายฝากเอ็มบริโอนับว่ามีความสำคัญมากเพราะเกี่ยวกับคุณค่าทางเศรษฐกิจของเพศหนึ่งสูงกว่าอีกเพศหนึ่ง ดังนั้ยจึงได้มีการพยายามอย่างมากที่จะแยกเพศของเอ็มบริโอโดยที่ไม่ทำให้ความแข็งแรงของเอ็มบริโอด้อยลงไป ซึ่งในอดีต วิธีการที่ใช้แยกเพศเอ็มบริโอที่ยังไม่ค่อยจะประสบผลสำเร็จสูงนักซึ่งได้แก่ การแยกเซลล์บางส่วนของเอ็มบริโอออกมาโดยวิธีจุลศัลยกรรมแล้วตรวจสอบดูโครโมโซมของเอ็มบริโอนั้น และโดยอาศัยพื้นฐานทางการตรวจแอนติเจนและแอนติบอดีจากภายนอกเมมเบรนของเซลล์เพศผู้ อีกวิธีหนึ่งที่เป็ฯไปได้คือ การดูปฏิกิริยาของเอนไซม์ กลูโคส ซิกฟอสเฟคดีไฮโดรจีเนส ที่เกาะเกี่ยวอยู่กับโครโมโซมเอ็กซ์ ซึ่งจะเกิดปฏิกิริยาที่ให้สีแตกต่างกันระหว่างเพศผู้กับเพศเมีย วิธีการทั้งสามไม่เป็นที่แพร่หลายใช้ในกิจการขนาดใหญ่

             ในปัจจุบันนี้ เราสามารถแยกเพศของเอ็มบริโอก่อนนำไปย้ายฝากได้แม่นยำกว่า 90% โดยใช้เทคนิค PCR (Polymerase Chain Reaction) เข้ามาช่วยในการตรวจสอบ ด้วยการตัดชิ้นส่วนของเซลล์ ในเอ็มบริโอออกมาเพียงเล็กน้อย แล้วนำมาตรวจด้วยเทคนิค PCR ก็จะทราบได้ว่าเอ็มบริโอนั้นมีรูปแบบของ DNA เป็นเพศผู้หรือเพศเมีย การแยกเพศโดยใช้ PCR ทั้งแบบที่ใช้และไม่ใช้ขั้นตอนของ electrophoresis มีการให้บริการในธุรกิจการย้ายฝากเอ็มบริโอ มาตั้งแต่ช่วงปี 1998-1999 ซึ่งเทคนิคทั้ง 2 แบบมีประสิทธิภาพและมีความแม่นยำสูง แต่การที่ต้องดูดเอาเซลล์บางส่วนของเอ็มบริโอมาออกมาตรวจ จำเป็ฯต้องใช้ความชำนาญงานเฉพาะ และ เป็นวิธีการที่มีอันตรายและมีผลต่อความแข็งแรงของเอ็มบริโอ การดำเนินงานทางเทคนิค PCR จำเป็นต้องมีความสะอาดสูงกว่าระบบปฏิบัติงานย้ายฝากเอ็มบริโอในทางอุตสาหกรรมทั่ว ๆ ไป แต่ก็มีบรีดเดอร์ที่ทันสมัยบางส่วน ยอมรับและใช้เทคนิคนี้ในการขยายปรับปรุงพันธุ์โค แต่ก็ยังเป็นเทคโนโลยีที่ใช้ยังไม่กว้างขวางนักในอุตสาหกรรมการย้ายฝากเอ็มบริโอ นอกจากนี้เทคนิค PCR สามารถใช้เซลล์บางส่วนที่ดูดออกมาจากเอ็มบริโดนี้ ไปตรวจสอบหายีนส์ที่ควบคุมลักษณะที่ต้องการ หรือตรวจหาความผิดปกติของยีนส์ที่จะนำไปสู่การเกิดโรคหรือความผิดปกติทางกายได้ ซึ่งจะเป็นประโยชน์อย่างมากในการคัดเลือกพันธุ์โคและลักษณะที่ต้องการได้ล่วงหน้า

การแยกเพศอสุจิ (Semen sexing)

             จากความก้าวหน้าทางด้าน flow cytometric technology ที่พัฒนามาใช้สำหรับการแยกอสุจิที่มีโครโมโซมเพศเป็น X หรือ Y ออกจากกัน ที่มีการศึกษาวิจัยมากว่า 10 ปีแล้ว ในปัจจุบัน สามารถผลิตอสุจิแยกเพศออกจำหน่ายในท้องตลาดแล้ว โดยสามารถแยกอสุจิที่มีชีวิตที่มีโครโมโซมเพศต่างกันออกจากกันได้บริสุทธิ ประมาณ 90% และสามารถแยกได้ด้วยความเร็ว 10 ล้านตัวต่อชั่งโมง ได้มีการทดลองนำเอาอสุจิแยกเพศที่ไม่ได้แช่แข็ง 600,000 ตัว ผสมให้กับโคสาวที่เร่งการตกไข่สามารถผลิตเอ็มบริโอได้ 4.3?5.3 เอ็มบิโอ/ตัว แต่เมื่อเป็นอสุจิแยกเพศที่แช่เข็งแล้ว มาทดลองใช้โดยมีความเข้มข้น 2 ล้าน และ 10 ล้าน ตัวต่อหลอด เทียบกัยอสุจิไม่ได้แยกเพศ เข้มข้น 40 ล้านตัวตอหลอดพบว่าเกิดการปฏิสนธิได้ 40%, 49% และ 69% ตามลำดับ และผลิตเอ็มบริโอที่ย้ายฝากได้ 3.3?0.9, 4.1?0.9, และ 8.7?0.9 เอ็มบริโอ/1 ตัวให้ ตามลำดับ และในการนำมาทดลองใช้ในการทำ IVF ก็ให้ผลคล้ายคลึงกันคืออัตราการปฏิสนธิ อัตรการแบ่งตัวและการเจริญถึงบลาสโตซิสต่ำลง อัตราการตั้งท้องก็ต่ำกว่า สำหรับการใช้ในการผสมเทียม จะทำให้อัตราการตั้งท้องเพียง 70-90% ของอสุจิที่ไม่แยกเพศ แต่ไม่แตกต่างกัน ด้านระยะการตั้งท้อง การตายหลังคลอด การคลอดง่าย น้ำหนักแรกเกิด หรือการมีชีวิตรอดถึงหย่านม นอกจากนี้การแยกเพศอสุจิ ยังอาจทำได้ด้วยการใช้ระบบภูมิต้านทานที่จำเพาะต่อความแตกต่างของโปรตีนที่อยู่รอบ ๆ เซลล์ เทคนิคนี้จะแยกอสุจิได้เร็วกว่า และเป็นอันตรายต่ออสุจิน้อยกว่า แต่ผลการวิจัยยังอยู่ในวงจำกัด แต่ก็มีความพยามที่จะผลักดันสู่ การผลิตเชิงการค้า